RESUMO
La epimastigogénesis de Trypanosoma cruzi es la transformación del tripomastigota sanguícola en epimastigota que ocurre en la porción anterior del tracto intestinal del insecto vector. Se ha reportado la activación de cisteín proteasas durante la epimastigogénesis in vitro en condiciones axénicas, sugiriendo la utilización de aminoácidos como fuente de carbono para la obtención de energía. El objetivo del presente trabajo fue estudiar a través de indicadores los cambios metabólicos producidos durante la diferenciación tripomastigota-epimastigota. Se partió de un 100% de tripomastigotas sobrenadantes de células Vero, incubados en medio LITB a 27ºC en condiciones de alta (epimastigogénesis horizontal) y baja (epimastigogénesis vertical) tensión de oxígeno. Se realizó contaje de parásitos (Cámara de Neubauer) y recuento diferencial (Giemsa) a diferentes tiempos de incubación (0, 1, 2, 4, 6, 8, 11 y 12 días). A cada tiempo se determinó en los sobrenadantes del medio de cultivo las concentraciones de glucosa y amoníaco, así como los valores de pH. Los resultados mostraron que: 1) Independientemente de la tensión de oxígeno se evidenció formas en diferenciación y amastigotas durante el proceso, siendo la aparición de epimastigotas más tardía en alta tensión de oxígeno; 2) El incremento poblacional fue significativamente mayor en condiciones de alta tensión de oxígeno, registrándose alta mortalidad de amastigotas durante los primeros días de incubación en la epimastigogénesis vertical; 3) El consumo de glucosa fue concomitante con la aparición de epimastigotas en ambas condiciones, siendo mayor en alta tensión de oxígeno; 4) No se registró liberación de amoníaco en ninguno de los casos estudiados; 5) Los valores de pH fueron similares hasta el sexto día en ambas condiciones, evidenciándose una acidificación gradual del medio de cultivo en alta tensión de oxígeno. Todo parece sugerir que durante la epimastigogénesis de T. cruzi, los parásitos involucrados en los procesos de diferenciación no muestran activación de las diferentes rutas metabólicas.
The epimastigogenesis of Trypanosoma cruzi is the transformation from bloodstream trypomastigote to epimastigote that occurs in the anterior portion of the intestinal tract of the insect vector. It has been reported cysteine proteases activation during axenic epimastigogenesis in vitro, suggesting the use of amino acids as a carbon source for the production of energy. The aim of this work was to study through indicators metabolic changes produced during the trypomastigote-epimastigote differentiation. We started with a 100% trypomastigotes derived from Vero cell supernatants, incubated in LITB medium at 27°C under high (horizontal epimastigogenesis) and low (vertical epimastigogenesis) oxygen tension. We estimated parasites number (Neubauer chamber) and differential morphology (Giemsa) at different incubation times (0, 1, 2, 4, 6, 8, 11 and 12 days). Each time was determined in the supernatants of the culture medium glucose and ammonia concentrations as well as the pH values. The results showed that: 1) Regardless of the oxygen tension it was evidenced differentiation forms and amastigote during the process, with the later occurrence of epimastigotes in high oxygen tension; 2) Population growth was significantly greater in high oxygen tension, registering high mortality of amastigotes during the firsts incubation days in the vertical epimastigogenesis; 3) Glucose consumption was concomitant with the appearance of epimastigotes in both conditions, being higher in high oxygen tension; 4) There was no ammonia release in any of the cases studied; 5) The pH values were similar to the sixth day in both conditions, showing gradual acidification of the culture medium at high oxygen tension. Everything seems to suggest that during the epimastigogenesis of T. cruzi parasites involved in differentiation processes show no activation of different metabolic pathways.
RESUMO
Se ha reportado cultivo axénico de amastigotas de Trypanosoma cruzi derivados de epimastigotas. Se cuestiona si formas redondas en cultivos axénicos son verdaderos amastigotas. Aquí se compararon los cambios biológicos y moleculares de epimastigotas creciendo en alta y baja tensión de oxígeno. T. cruzi (EPm6) se creció en frascos con diferentes alturas de medio LITB (condición horizontal 3 mm y vertical 83 mm). Se colectaron masas de parásitos de diferentes tiempos de crecimiento para análisis proteico, glicoproteico y antigénico. Se estudiaron los cambios morfológicos, incremento de inóculo y resistencia al complemento por microscopia de fases y tinción con Giemsa. Los cambios proteicos y glicoproteicos se compararon por SDS-PAGE. Los cambios antigénicos se analizaron por Western blot con suero de conejo y anticuerpos IgY contra formas amastigotas. En condición vertical, los epimastigotas mantuvieron su morfología típica a lo largo de la curva de crecimiento y no mostraron cambios moleculares significativos. En condición horizontal al 4to y 6to día predominaron formas redondas con capacidad de resistir la lisis por complemento. A partir del 4to día se observaron cambios en los perfiles proteicos y glicoproteicos, concomitantemente con los cambios morfológicos. El suero anti-amastigotas reveló un antígeno amastigota-específico transitorio de 55 kDa en parásitos de 4 días en la condición horizontal, mientras el anticuerpo IgY anti-amastigotas no reveló diferencias entre parásitos creciendo en ambas condiciones. Estas evidencias sugieren que epimastigotas de T. cruzi condicionados a sobrevivir en alta tensión de oxígeno puede mimetizar propiedades biológicas y antigénicas propias del estadio amastigota.
Axenic culture of epimastigote-derived amastigotes of Trypanosoma cruzi has been reported. Have been inquired why round forms appear in culture media and if are true amastigotes. Our proposal was study molecular and biological changes in epimastigotes growing in high and low oxygen tension. T. cruzi (EPm6) were grown in flasks with different height of LITB medium (horizontal condition 3 mm and vertical 83 mm). Parasites were collected masses of different times of growth for proteins, glycoproteins and antigenic analysis. Morphological changes, increase of inoculum and resistance to complement lyses were studied in phases microscopy and Giemsa-stained smears. Protein and glycoprotein changes were compared by SDS-PAGE. Antigenic changes were analyzed by Western blot with rabbit serum and IgY antibody against amastigote forms. In vertical condition, the epimastigote maintained its typical morphology along the growth curve and not showed significant molecular changes. In horizontal condition round forms prevailed at 4 and 6 days with capacity to resist lyses by complement. From the 4th day changes in proteins and glycoproteins profiles were observed, concomitantly with the morphological changes. Anti-amastigotes serum revealed a 55 kDa transitory amastigote-specific antigen in four day parasites from horizontal condition, while IgY antibody anti-amastigotes dont revealed differences between parasites grown in both conditions. These evidences suggest that epimastigotes of T. cruzi conditioned to survive in high oxygen tension can mimic biological and antigenic properties own the amastigote-stage.
RESUMO
El medio ML15-HA permite simular in vitro los eventos morfogenéticos del ciclo vital de T. cruzi. Se ha evidenciado que los cambios morfológicos de la epimastigogénesis del clon Dm28c de T. cruzi en ML15-HA, ocurren más rápidamente que para otros aislados. Nuestro propósito fue investigar si los cambios macromoleculares ocurren concomitantemente con la rápida transformación morfológica. Tripomastigotas derivados de células infectadas se incubaron por diferentes tiempos en medio ML15-HA a 27ºC. Los cambios morfológicos se determinaron por microscopía de contraste de fases y coloración con Giemsa. Los perfiles peptídico y glicopeptídico se analizaron mediante SDS-PAGE y coloraciones específicas. Los cambios antigénicos se estudiaron mediante Western blot usando sueros anti-Tripomastigotas y anti-Epimastigotas. Los resultados muestran: (1) caída del porcentaje de tripomastigotas e incremento de amastigotas en las primeras 24 horas, con incremento gradual de epimastigotas a partir de 48 horas; (2) tres perfiles peptídicos y glicopeptídicos diferentes: tripomastigotas, epimastigotas a partir del día 4, y un perfil intermedio los días 2 y 3, demostrando la estrecha correlación entre los eventos morfológicos y los cambios proteicos y glicoproteicos; (3) los perfiles antigénicos revelaron estrecha relación entre los cambios morfológicos y la expresión de antígenos estadio-específicos. Los resultados obtenidos evidencian de manera concluyente que los cambios moleculares son más acelerados para el clon Dm28c en medio ML15-HA que en otros medios. Estos hallazgos abren la interrogante, sí la velocidad de la epimastigogénesis está determinada por la constitución genética del aislado o por la riqueza nutricional del medio de diferenciación.
The ML15-HA medium allows simulate in vitro morphogenetic events in the life cycle of T. cruzi. It has been demonstrated that the morphological changes of epimastigogenesis in ML15-HA of the T. cruzi clone Dm28c, occur faster than for other isolates. Our purpose was to investigate whether macromolecular changes occur concomitantly with rapid morphological transformation. Trypomastigotes derived from infected cells were incubated for different times in ML15-HA medium at 27°C. Morphological changes were determined by phase contrast microscopy and staining with Giemsa. Peptide and glycopeptide profiles were analyzed by SDS-PAGE and specific staining. Antigenic changes were studied by Western blot using serum anti-trypomastigotes and anti-epimastigotes. The results show: (1) decline in the percentage of trypomastigotes and amastigotes increased in the first 24 hours, epimastigotes gradually increases from 48 hours, (2) three peptide and glycopeptide profiles different: trypomastigotes, epimastigotes from the day 4 and an intermediate profile on days 2 and 3, showing the close correlation between morphological events and protein and glycoprotein changes, (3) antigenic profiles showed close relationship between the morphological changes and the expression of stage-specific antigens. The results show conclusively that the molecular changes are more rapid for clone Dm28c in ML15-HA medium than in other media. These findings open the question, if the epimastigogenesis speed is determined by the genetic constitution of isolated or nutritional wealth differentiation medium.
RESUMO
La metaciclogénesis de Trypanosoma cruzi es la transformación del estadio epimastigota en tripomastigota metacíciclico que ocurre en la ampolla rectal del insecto vector. Durante este proceso se ha implicado una activación del metabolismo proteico, con probable participación de proteasas en la degradación de proteínas del parásito. En el presente trabajo se determinó el efecto de las condiciones de mantenimiento de T. cruzi en el laboratorio sobre la actividad de proteasas y su relación sobre la metaciclogénesis espontánea en cultivos axénicos. Se trabajó con el clon Dm30L de Trypanosoma cruzi mantenido en el laboratorio mediante pases trimestrales chipo-ratón (condición triatomino: CT) o repiques semanales durante 15 años en medio LITB (condición cultivo: CC). En ambas condiciones, se hizo curva de crecimiento durante 30 días en medio LITB suplementado con 10, 24 y 48 mM glucosa, calculándose el porcentaje de metacíclicos espontáneos y determinación de la actividad de proteasas. En 10 mM glucosa, parásitos de la CT presentaron mayor expresión de proteasas y porcentaje de metacíclicos respecto a la CC. En la CT, el crecimiento en 48 mM glucosa redujo las variables antes mencionadas, mientras que no se evidenció actividad proteolítica ni metaciclogénesis espontánea en parásitos de la CC en altas concentraciones de glucosa. En todos los casos se evidenció mayor actividad de cisteín proteasas durante la fase estacionaria del cultivo. No se reportó actividades metaloproteasas en ninguna de las condiciones estudiadas, pero sí en el clon Dm28c utilizado como control de la expresión de este tipo de enzima. Estos resultados sugieren que la expresión de proteasas está influenciada por la constitución genética del parásito y que la CC provoca disminución de la actividad proteolítica que persisten aún en condiciones de agotamiento de carbohidratos del medio, con una concomitante reducción significativa en el porcentaje de metacíclicos espontáneos.
Trypanosoma cruzi metacyclogenesis is the transformation of epimastigote stage to trypomastigote metacyclic that happens in the rectal ampulla of the insect vector. During this process it has been implicated protein metabolism activation, with proteases likely involvement in parasite protein degradation. In this study we determined the effect of T. cruzi keeping conditions in the laboratory on the activity of proteases and their relationship on spontaneous metacyclogenesis in axenic culture. We worked with Trypanosoma cruzi Dm30L clone maintained in the laboratory by quarterly passes triatomine-mouse (triatomine condition: TC) or serial culture media during 15 years in LITB medium (culture condition: CC). In both conditions, growth curve was made for 30 days in LITB medium supplemented with 10, 24 and 48 mM glucose, calculating the percentage of spontaneous metacyclics and determining proteases activity. In 10 mM glucose, TC parasites showed higher expression of proteases and metacyclic percentage relative to the CC. In TC, the growth in 48 mM glucose reduced the above variables, while no evidenced proteolytic activity nor spontaneous metacyclogenesis on CC parasites in high glucose concentrations. In all cases there was greater cysteine proteases activity during the stationary phase of the culture. Metalloprotease activity was not reported in any of the conditions studied, but it was detected in clone Dm28c used as control of expression of this type of enzyme. These results suggest that the expression of proteases is influenced by the genetic makeup of the parasite and the CC causes decrease of proteolytic activity which persists even in carbohydrate depleted conditions of the medium, with a concomitant significant reduction in the percentage of spontaneous metacyclics.
RESUMO
La transformación de tripomastigotas sanguíneos de Trypanosoma cruzi en epimastigotas, ocurre naturalmente en el intestino del insecto y se identifica como epimastigogénesis. Aquí reportamos que durante la epimastigogénesis in vitro, los tripomastigotas se transforman en formas redondeadas, biológica y antigénicamente equivalentes al estadio amastigota; con un tiempo de persistencia dependiente de la altura del medio de cultivo. Formas tripomastigotas procedentes de cultivo de tejidos infectados se incubaron en envases con diferentes alturas de medio LITB (3 y 83 mm), y se compararon las cinéticas de transformación hacia epimastigotas. Para la obtención de antígenos se colectaron masas de parásitos a diferentes tiempos de diferenciación. Los cambios morfológicos, incremento del inóculo y resistencia a complemento, se estudiaron por microscopía de contraste de fases y extendidos coloreados con Giemsa. Los cambios antigénicos se analizaron mediante Western Blot usando anticuerpo IgY anti-amastigotas. Los resultados mostraron que las formas redondeadas resisten la lisis por complemento, expresan antígenos amastigota-específicos y la velocidad de transformación hacia epimastigotas depende de la altura del medio sobrenadante en el cultivo. Las evidencias sugieren que además de caída de la temperatura, una baja tensión de oxígeno disuelto y una alta densidad de parásitos por área, aceleran el proceso de diferenciación.
Transformation of blood Trypanosoma cruzi tripomastigotes into epimastigotes occurs naturally at the insect gut and is identified as epimastigogenesis. Here we report that during in vitro epimastigogenesis, tripomastigotes transform into rounded forms, biologically and antigenically equivalent to the amastigote stadium, with a persistance time which depends on the height of the culture medium. Tripomastigote forms from cultures of infected tissues were incubated in flasks with different LITB medium heights (3 and 83 mm), and kinetics of transformation to epimastigotes were compared. Masses of parasites at different differentiation times were collected for antigen production. Morphological changes, inoculum increase and resistance to complement were studied by phase contrast microscopy and Giemsa stained smears. Antigenic changes were analyzed through Western Blot using an IgY anti-amastigote antibody. Results showed that rounded forms resist lysis by complement, express amastigote-specific antigens, and that the speed of transformation to epimastigotes depends on the height of the supernatant medium in the culture. Evidences suggest that apart from a temperature fall, a low dissolved oxygen tension and a high parasite per area density accelerate the differentiation process.
RESUMO
No obstante las ventajas de producir anticuerpos en gallinas, no se ha reportado inducción y purificación de anticuerpos contra estadios de Trypanosoma cruzi en el modelo aviario. La inducción de anticuerpos anti-estadios de T. cruzi en gallina puede garantizar la producción de reactivos útiles en diagnóstico y terapéutica de la enfermedad de Chagas. Aquí reportamos la obtención y rápido aislamiento de IGY procedente de yema de huevos de gallinas inmunizadas contra epimastigotas de T. cruzi a los 7, 22 y 61 días post-inmunización. Se compararon tres estrategias de purificación de IgY: el método de la dilución acuosa, el método del polietilén glicol (PEG) y el método del cloroformo-PEG, respecto a un estuche comercial. El método del cloroformo-PEG dio un rendimiento de 6,4 mg/mL de proteínas de yema de huevo de 61 días con una sensibilidad tal que 7 ng de IgY detectaron 1 µg de antígeno (ELISA). Por Western blot, 5 µg/mL de IgY revelaron 11 antígenos diferentes en 8 µg de proteína total de epimastigotas. El análisis por SDS-PAGE demostró que las IgY extraídas contienen dos bandas proteícas dominantes de 70/57 y 37/35 kDa y dos tenues de 81 y 41 kDa, las cuales pueden ser eliminadas por re-precipitación con PEG. Para la extracción de IgY el método del cloroformo-polietilén glicol dio la mejor combinación por facilidad de ejecución y bajo costo. Si bien rindió 50 por ciento menos que el estuche comercial bajo las mismas condiciones, la sensibilidad de los anticuerpos fue 4 veces mayor. Estos resultados evidencian la factibilidad del modelo aviario para producir anticuerpos contra estadios de T. cruzi y muestran la experticia para purificarlos usando una tecnología local de bajo costo
Assuntos
Animais , Anticorpos , Clorofórmio , Imunoglobulinas , Trypanosoma cruzi , Gema de Ovo , Biologia Molecular , Parasitologia , VenezuelaRESUMO
Attempts to recreate all the developmental stages of Trypanosoma cruzi in vitro have thus far been met with partial success. It is possible, for instance, to produce trypomastigotes in tissue culture and to obtain metacyclic trypomastigotes in axenic conditions. Even though T. cruzi amastigotes are known to differentiate from trypomastigotes and metacyclic trypomastigotes, it has only been possible to generate amastigotes in vitro from the tissue-culture-derived trypomastigotes. The factors and culture conditions required to trigger the transformation of metacyclic trypomastigotes into amastigotes are as yet undetermined. We show here that pre-incubation of metacyclic trypomastigotes in culture (MEMTAU) medium at 37ºC for 48 h is sufficient to commit the parasites to the transformation process. After 72 h of incubation in fresh MEMTAU medium, 90 percent of the metacyclic parasites differentiate into forms that are morphologically indistinguishable from normal amastigotes. SDS-PAGE, Western blot and PAABS analyses indicate that the transformation of axenic metacyclic trypomastigotes to amastigotes is associated with protein, glycoprotein and antigenic modifications. These data suggest that (a) T. cruzi amastigotes can be obtained axenically in large amounts from metacyclic trypomastigotes, and (b) the amastigotes thus obtained are morphological, biological and antigenically similar to intracellular amastigotes. Consequently, this experimental system may facilitate a direct, in vitro assessment of the mechanisms that enable T. cruzi metacyclic trypomastigotes to transform into amastigotes in the cells of mammalian hosts
Assuntos
Animais , Proteínas de Protozoários , Trypanosoma cruzi , Western Blotting , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Vida Livre de Germes , Glicopeptídeos , Microscopia Eletrônica de Varredura , Peptídeos , TemperaturaRESUMO
The amastigogenesis primary of T. cruzi occurs naturally when metacyclic trypomastigotes transform into amastigotes within the cells of the mammalian host. The in vitro study of the macromolecular changes that occur over several days during the transformation process should provide significant indications of how the parasite adapts to the mammalian host environment. We show here that metacyclic trypomastigotes pre-incubated at 37 degrees C in a protein-rich medium reach a high degree of transformation to amastigotes when re-incubated in the fresh medium. Giemsa-stained smears show that during the pre-incubation phase, the metacyclic trypomastigotes undergo lengthening at the posterior end and a thinning out of the entire body. SDS-PAGE analysis of polypeptides and glycopeptides or Western blot with stage-specific antisera analyses indicate that the in vitro primary amastigogenesis is associated with abrupt changes in protein, glycoprotein, and stage-specific antigens that occur simultaneously during the first 24 hours of pre-incubation. Since the differentiating system consists of a rich media at 37 degrees C, temperature and medium constitution must trigger a macromolecular differentiation to amastigotes that precedes the morphological transformation by several days. This transformation is associated with the rearrangement of stage-specific antigens and takes place when the culture medium is changed.